细胞融合的技术手段多种多样，包括物理、化学及生物方法。物理方法如电融合和激光融合，化学方法则包括聚乙二醇（PEG）融合法，另外也可以采用生物方法，比如使用灭活的仙台病毒。PEG在分子量为200至700时为无色、无臭的粘稠液体，而当分子量超过1000时，则为乳白色蜡状固体，它能够在水、乙醇及多种有机溶剂中溶解，具备良好的热稳定性，并对多种化学药物不具反应性。

在细胞融合过程中，通常选择分子量为4000的PEG作为融合剂，常用浓度为50%，pH值为80至82（可用10% NaHCO3进行调整）。当使用低分子量的PEG时，虽然可以产生融合效果但毒性较高；而分子量过大的PEG则会因其粘性太大而难以操作。经过研究发现，50%的浓度以及偏碱的pH条件下，融合效果最佳。此外，还可以尝试使用30%至50%浓度的PEG结合10%二甲亚砜。值得注意的是，即使PEG的分子量相同，不同批次之间的融合率可能存在显著差异，因此购入时需特别留意，并在每批次使用前进行细胞毒性测试。优选高纯度的PEG，通常选用用于气相色谱的产品。

在具体的融合操作中，常用的技术有转动法和离心法。进行细胞融合时，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例一般在1:1到10:1之间，3:1或5:1的比例最为普遍。

实验材料与试剂

1. 脾细胞及骨髓瘤细胞。
2. 1640培养液100ml。
3. 完全1640培养液100ml。
4. 25% FCS－1640液50ml。
5. HAT培养液100ml。
6. 50% PEG：选用分子量4000的高纯度PEG（如日本进口或Serva），10g放入25ml的瓶中高压灭菌，使用前加入10ml预热至40℃的1640液，以酚红检查pH。若pH有变化，可适量用HCl或NaHCO3进行调整。
7. 10ml与50ml的灭菌沉淀管或瓶。
8. 40孔塑料培养盘。

操作步骤

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml的25% FCS－1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，沉淀细胞。
4. 移去上清液。
5. 轻轻敲打管底，使沉淀流动，将沉淀管置于40℃水浴中以达到融合温度。
6. 加入8ml预热至40℃的50% PEG，使用1ml吸管慢慢滴加，同时轻摇沉淀管，观察是否出现颗粒，滴加时间约为2分钟。
7. 加入1ml 1640液，持续摇动1分钟。
8. 重复第7步一次。
9. 继续加入1ml 1640液，摇动持续0.5分钟。
10. 重复第9步一次。
11. 最后加入15ml 1640液。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 去除上清，轻敲管底部，加入25ml含有HAT的完全1640液。
14. 将融合的细胞液分别滴加到已接种有培养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔1滴（约0.05ml）。
15. 轻轻摇晃后，放置于5% CO2饱和湿度的37℃培养箱中。
16. 在第3、6、9、10天更换为含HAT的完全1640培养液，注意轻轻吸取上清液，避免将固定在孔底的细胞吸出，并根据需要加入适量的培养细胞。
17. 在第12、15天继续加含HAT的完全1640培养液。每次换液前，用倒置显微镜观察，通常在10天左右可以见到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10至20天内出现，也有的在1个月左右才可被观察到。

在杂交瘤细胞出现后，需吸取上清液并检查抗体。对于继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代，在传代过程中根据情况逐步取消HAT液和完全1640液，改用10% FCS－1640液。同时，需将细胞保存于液氮中并进行克隆化，在此期间每代都要监测抗体，以防止抗体细胞的变异和流失。

细胞融合的关键要素

细胞融合过程中，技术上的细微差异可能导致融合失败。例如，供者淋巴细胞未进行免疫应答会导致融合必然失败。此外，最大的失败原因通常是污染，因此在融合实验中，提供一个无毒无菌的操作环境是确保融合成功的关键。

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